شروع یک آزمایش به معنای پرسیدن سوالات زیادی است. چه موادی مورد نیاز است؟ از چه نمونه هایی استفاده می شود؟ چه شرایطی برای آزمایش لازم است؟ چقدر زمان لازم است؟ و … . اما در این میان، اغلب یک سوال فراموش می شود که از اهمیت کمتری نیز برخوردار نیست. چه مایعاتی در حین آزمایش استفاده می شوند، ویژگی های مختلف این مایعات چیست و روش پیپتینگ آنها چگونه خواهد بود؟ از آنجایی که پیپت کردن مایعات، یک کار روزمره و در نظر بسیاری، یک فرآیند راحت و ساده است، معمولاً زمان و تلاش زیادی برای این موضوع صرف نشده و از تاثیر آن بر پیپتینگ غفلت می شود. اما در این میان نکات زیادی وجود دارد که باید به آنها توجه کرد. برای یادگیری نحوه عملکرد مایعات مختلف هنگام پیپتینگ، در این مقاله با ما همراه باشید!
یکی از اساسی ترین تجهیزات آزمایشگاهی، میکروپیپت های جابجایی هوا هستند. این نوع میکروپپیت ها، از اصل بالشتک هوا استفاده کرده و برای کارهای روتین آزمایشگاهی مناسب هستند (برای مطالعه بیشتر در مورد میکروپپیت های جابجایی هوا اینجا کلیک کنید). میکروپیپت های مدرن جابجایی هوا، امکان دست یابی به درجه بالایی از دقت و صحت را فراهم می کنند، به خصوص در حین پیپت کردن مایعات آبی. این میکروپیپت ها، معمولاً توسط آب کالیبره و تنظیم می شوند (برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد فرآیند بررسی و کالیبراسیون میکروپپیت اینجا کلیک کنید). آب به عنوان مایع مرجع مورد قبول بوده، زیرا خواص فیزیکی آب در شرایط مختلف محیطی به خوبی شناخته شده است. با اینحال، اکثر آزمایشگاه‌ها با مایعاتی کار می کنند که نسبت به مایع ایده‌آل آب رفتار متفاوتی نشان می دهند، از جمله سرم، خون، پروتئین‌ها، روغن، مواد شوینده، حلال‌ها یا نمک‌ها. با استفاده از این نوع مایعات، ممکن است خطاهایی در فرآیند سنجش رخ دهد که همه اینها به حجم مورد نظر بستگی دارد. هر چند، با استفاده از میکروپیپت های بالشتک هوا، بیشتر مایعات را می توان با دقت بیشتری نسبت به میکروپیپت های جابجایی مثبت منتقل کرد، اما برخی از ویژگی های مایع و عوامل محیطی ممکن است باعث انحراف در حجم مایع مورد نظر شوند. رفتار متفاوت مایع، تحت تاثیر هوای موجود در میکروپپیت بوده و در هنگام استفاده از میکروپیپت باید در نظر گرفته شود.
مایعات را می توان در پنج دسته اصلی دسته بندی کرد: محلول های آبی، ویسکوز (شامل دترجنت ها)، محلول های فرار، محلول های با چگالی بالا و محلول های عفونی یا سمی. مدیریت نادرست مایعات، می تواند تأثیر فوق العاده ای را بر نتیجه پیپتینگ داشته باشد. هنگام پیپت کردن مایعاتی که با آب متفاوت هستند، ویژگی هایی مانند چگالی، ویسکوزیته، کشش سطحی و فشار بخار برای پیپت کردن موفقیت آمیز حیاتی هستند. ویژگی های مایع برای توضیح تأثیرات مشاهده شده بصورت جداگانه قابل توضیح هستند، هر چند، در یک محیط آزمایشگاهی واقعی، انتقال مایع همیشه تحت تأثیر ترکیبی از این عوامل قرار می گیرد.
بنابراین، در نظر گرفتن نوع و ماهیت محلول مورد استفاده قبل از شروع آزمایش می تواند گردش کار و نتایج شما را ساده و بهبود بخشد. در ادامه، برای درک بهتر، هر کدام از این ویژگی ها به تنهایی توضیح داده می شود. بنابراین، اثر ترکیبی را می توان بهتر درک کرد.
ویژگی های مایع که بر نتایج پیپتینگ تاثیرگذار است!
فراریت محلول
در حالی که پیپتینگ محلول های آبی مانند اکثر بافرها نسبتاً ساده بوده و عمدتاً با میکروپیپت های بالشتک هوا انجام می شود، ممکن است هنگام پیپت کردن مایعات فرار مانند استون مشکلاتی ایجاد شود. مایعات فرار دارای فشار بخار بالایی هستند که باعث تبخیر آن به داخل بالشتک هوا و در نتیجه نشت مایع از سرسمپلر می شود که به معنای از دست دادن نمونه یا معرف، بدون روش صحیح پیپت کردن است. هنگام پیپت کردن مایعات فرار، خیس کردن سرسمپلر (چرخه های مکرر آسپیراسیون و دیسپنس برای مرطوب کردن هوای داخل سرسمپلر) برای افزایش دقت میکروپیپت ضروری است. برای مطالعه بیشتر در مورد روش های بهبود پیپتینگ محلول های فرار اینجا کلیک کنید.
ویسکوزیته محلول
دسته دیگر از مایعات که رفتار کاملاً متفاوتی را نشان می دهند، مایعات ویسکوز مانند گلیسرول هستند. این مایعات اصطکاک داخلی بالای بین مولکولی دارند که باعث رفتار جریانی بسیار آهسته و در نتیجه آسپیراسیون حباب هوا، باقیماندن مایع و نمونه در سرسمپلر و از دست دادن معرف می شود. ویسکوزیته خاصیتی است که حرکت را محدود می کند. بنابراین، مایعی با ویسکوزیته بالا (مثلا گلیسرول) به آرامی به داخل و خارج سرسمپلر جریان می یابد. اگر سرسمپلر خیلی زود از مخزن مایع خارج شود، حباب هوا نیز به داخل سرسمپلر کشیده می شود و حجم مایع برداشته شده را کاهش می دهد. در حین توزیع مایعات ویسکوز، یک لایه مایع بر روی دیواره داخلی سرسمپلر باقی مانده و این لایه کندتر از بقیه مایع به سمت پایین جریان می یابد. اگر پیستون خیلی سریع فشار داده شود، به دلیل این حرکت آهسته مقداری از مایع در سرسمپلر باقی می ماند. نتایج را می توان با کاهش سرعت میکروپیپت بهبود بخشید. آسپیراسیون آهسته به مایع اجازه می دهد تا به سطح تعادل برسد و توزیع آهسته، اثر لایه احتباس مایع را کاهش می دهد. استفاده از سرسمپلرهای دهانه گشاد، آسپیراسیون و انتشار مایع را آسان‌تر می‌کند و به مایع اجازه می‌دهد آزادانه‌تر از طریق دهانه سرسمپلر حرکت کند (برای آشنایی با انواع سرسمپلر اینجا کلیک کنید).
هنگام استفاده از میکروپیپت های بالشتک هوا برای کشیدن مایعات ویسکوز، یک روش خاص پیپتینگ به نام پیپتینگ معکوس توصیه می شود (برای مطالعه بییشتر درمورد انواع روش های پیپتینگ و روش پیپتینگ معکوس اینجا کلیک کنید). اما بهتر از آن، استفاده از میکروپپیت های جابجایی مثبت با نوک سرنگ مانند است که بدون بالشتک هوا بین نمونه و پیستون داخل سرسمپلر کار می‌کند. با این ابزارها می توان مایع را سریعتر و راحت تر آسپیره کرد. هنگام توزیع یک مایع ویسکوز، حجم کامل را می توان بدون باقی ماندن آن در سرسمپلر توزیع کرد. برای مطالعه بیشتر در مورد روش های بهبود پیپتینگ محلول های ویسکوز اینجا کلیک کنید.
دانسیته یا چگالی محلول
در میکروپیپت های بالشتک هوا، بین مایع و پیستون، یک فضای هوایی وجود دارد که مانند فنر عمل می کند. مایعات با چگالی بالاتر، دارای جرم بیشتری در واحد حجم بوده و نیروی گرانشی بسیار بیشتری بر فضای هوایی بین پیستون و سیال اعمال می کنند. وقتی یک میکروپیپت توسط آب تنظیم می شود، همان میکروپیپت حجم بیشتری از مایع با چگالی کمتر را بر می دارد. این به این دلیل است که حجمی که با آب به دست می‌آید، در مقایسه با مایع با چگالی کمتر، سبک‌تر است. بالشتک هوا با این حجم در حالت تعادل نیست و بنابراین مایع را کمی بیشتر از آب می کشد. اثر معکوس توسط مایع متراکم تر ایجاد می شود. چگالی بالاتر نیروی بیشتری را به بالشتک هوا تحمیل کرده و باعث کشیده شدن آن می شود و در نتیجه حجم مایع کمتری به داخل سرسمپلر کشیده می شود.
اثر چگالی را می توان با در نظر گرفتن چگالی مایع و انتقال مقدار متفاوتی از مایع به حداقل رساند. توصیه نمی شود که میکروپپیت را با مایعات دیگری غیر از آب تنظیم کرد. به این دلیل که از میکروپیپت ها برای کار با مایعات مختلف استفاده می شود که هر کدام خواص متفاوتی دارند. استفاده از مایع مرجع مانند آب برای بررسی عملکرد میکروپیپت قابل اعتمادتر است. اثر سایر مایعات را می توان با کالیبراسیون و تغییر حجم برداشته شده بر این اساس ارزیابی کرد (یعنی اگر نتیجه کالیبراسیون ۵ میکرولیتر حجم کمتری در تنظیم ۵۰۰ میکرولیتر به دست آورد، می توان با تنظیم حجم برداشته شده روی ۵۰۵ میکرولیتر، اصلاح را انجام داده و تفاوت حجم را جبران کرد).
چگالی همیشه اثر ترکیبی با عوامل دیگر دارد و بنابراین ارائه مثال های خوب دشوار است. محلول های معدنی نمکی ممکن است به عنوان مثالی از این محلول ها باشند. وقتی حجم روی ۱۰۰۰ میکرولیتر تنظیم می شود، میکروپیپت در هنگام پیپت کردن محلول آب NaCl اشباع در مقایسه با آب خالص، تقریباً ۱ میکرولیتر حجم کمتری را می کشد. محلول های نمکی دیگر ممکن است نتایج متفاوتی به همراه داشته باشند.
فشار بخار و تبخیر محلول
هر مایع، تعادلی بین حالت مایع و گاز ایجاد می کند. برای رسیدن به این تعادل، مایع تبخیر می شود تا زمانی که غلظت خاصی در اتمسفر اطراف وجود داشته باشد. فشار بخار یکی از ویژگی های مایع است که نشان می دهد مایع با چه سرعتی به نقطه تعادل می رسد. زمانی که مایعات دارای فشار بخار زیاد به داخل سرسمپلر کشیده می شوند شروع به تبخیر در فضای بالشتک هوا می کنند. فضای هوا به دلیل مایع تبخیر شده منبسط می شود و از آنجایی که هیچ راه دیگری برای کاهش فشار وجود ندارد، شروع به هل دادن مایع از طریق نوک سرسمپلر می کند. گاهی کاربران این موضوع را به اشتباه نشت مایع در نظر می گیرند، در حالیکه یک پدیده طبیعی است. در یک سری پیپتینگ، اولین سری های پیپتینگ، باعث برداشت و تحویل حجم های کمتر می شود، زیرا انبساط فاز گاز، مانع از ورود مقداری از مایع به سرسمپلر می شود. تبخیر یک پدیده پیوسته است. بنابراین، باید به یاد داشت که مایعات فرار نیز در حین توزیع تبخیر می شوند. حجم ورودی به ظرف مورد نظر کمتر از مقداری است که قبل از توزیع در سرسمپلر وجود داشت. این امر می تواند به خصوص در کار با حجم های کوچک قابل توجه باشد.
برای کاهش اثرات تبخیر، توصیه می شود سرسمپلر را از قبل خیس کنید. آسپیراسیون و توزیع چند باره محلول مورد استفاده، فضای بالشتک هوا را به نقطه تعادل نزدیک می کند. بعد از خیس کردن در طول سری مراحل پیپتینگ، تفاوت بین حجم های متوالی کوچکتر شده و پدیده “نشت” به حداقل می رسد. برای مطالعه بیشتر در مورد تاثیر فشار بخار و دما بر دقت کار با میکروپیپت اینجا کلیک کنید.
کشش سطحی محلول
کشش سطحی، قدرت نیروهای بین مولکولی را توصیف می کند که توده مایع را کنار هم نگه می دارد. یک مثال خوب از یک مایع با کشش سطحی بالا آب است. افزودنی های استفاده شده در محلول های آبی، کشش سطحی محیط را کاهش می دهند، هر چند اختصاصیت آنالیز را بهبود می بخشند. از آنجایی که سورفکتانت ها، کشش سطحی را کاهش می دهند، توانایی مرطوب کنندگی مایع تغییر می کند. یک لایه بسیار نازک از مایع روی دیواره‌های سرسمپلر باقی می‌ماند که کندتر از بقیه مایع به سمت پایین جریان می‌یابد. این اثر شبیه رفتار مایعات ویسکوز است، اما لایه مایع باقی مانده بسیار نازک تر است. گاهی اوقات در مورد مایعات بی رنگ، این لایه غیر قابل تشخیص است. پس از توزیع مایع، ممکن است مقداری از مایع همچنان در سرسمپلر باقی بماند. کشش سطحی تمایل الاستیک همه مایعات را توصیف می کند که باعث می شود آنها کمترین سطح ممکن را به دست آورند. آب نمونه ای عالی از مایعات با کشش سطحی بالاتر است و دترجنت هایی مانند Triton X-100 نمونه هایی از مایعات با کشش سطحی پایین هستند. مانند مایعات ویسکوز، پیپت کردن کندتر و پیپتینگ معکوس می تواند اثرات کشش سطح پایین تر را خنثی کند.
کف کردن محلول
افزودنی ها همچنین ممکن است باعث ایجاد تمایل به ایجاد کف در مایعات شوند. به همین دلیل ممکن است مقداری از مایع در داخل حباب حاصل از کف گیر کرده و پس از توزیع در سرسمپلر باقی بماند. این امر به این دلیل است که حجم ترکیبی مایع و کف معمولاً بزرگتر از حجم تنطیم شده برای توزیع است. کف همچنین ممکن است باعث ایجاد اختلالات ناخواسته در مراحل بعدی کار (به عنوان مثال، اندازه‌گیری‌های فتومتریک) شود. تاثیر کاهش کشش سطحی را می توان با کاهش سرعت پیپت کردن به حداقل رساند. علاوه بر این، اثر احتباس مایع را می توان با استفاده از روش پیپتینگ معکوس کاهش داد.
شایان ذکر است که برخی از مایعات مانند الکل ها به اصطلاح اثر برف پاک کن دارند. گریس روان کننده در میکروپیپت پس از چندین بار پیپت کردن با این نوع مایعات از سطوح لغزنده جدا شده و پیستون شروع به گیر کردن می کند. با چند بار حرکت دادن پیستون بدون مایع می توان این مشکل را رفع کرد.
نتیجه گیری
خواص فیزیکی مایعات ممکن است باعث ایجاد انحرافات قابل توجهی در فرآینده جابجایی مایعات شود، مگر اینکه در نظر گرفته شوند. این ویژگی ها بسته به موقعیت، رفتارهای متفاوتی را در حجم مایع ایجاد می کنند. می توان اثرات مشاهده شده را با تغییر تکنیک و سرعت پیپت کاهش داد. البته باید در نظر داشت که خواص مایع تنها عوامل تاثیرگذار نیستند، بلکه همیشه نتیجه، ترکیبی از پدیده های مختلف است. بنابراین، برای تایید اثرات واقعی باید کالیبراسیون انجام شود.
منابع :
https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/D00178.pdf
کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی و علاقمند به نویسندگی و ترجمه در حوزه علوم آزمایشگاهی، ژنتیک، علوم سلولی-مولکولی و تجهیزات آزمایشگاهی. مترجم زبان انگلیسی از سال ۱۳۹۰